A continuação do sucesso de 2006 traz no elenco, além de Ben Stiller, vários atores que participaram do primeiro filme, além dos personagens novos. A aventura acontece na Smithsonian Institution, que abriga o maior complexo de museus do mundo. É lá que que o ex-guarda noturno Larry Daley se reencontra com os personagens históricos que tomam vida quando as luzes do museu se apagam.